تولید کلون و بررسی بیان توالی همپوشانی از ژن ns۳ ویروس هپاتیت c به‏وسیله سازه بیانی dna

هدف: هدف تولید یک سازه بیان کننده توالی یک ناحیه همپوشان از ژن ns3 از ویروس ایزوله ایرانی است. مواد و روش‏ها: ابتدا بخش میانی ژن ns3 با روش nested-rt-pcr و با استفاده از سرم بیمار مبتلا به ژنوتیپ 1a ویروس هپاتیت c تکثیر شد. بعد از کلون آن درون ناقل کلونینگ ta و غربالگری کلون‏ها براساس روش سفید- آبی و colony-pcr این کلون‏های منتخب با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی با bglii ارزیابی شد. توالی جدید با استفاده از نرم‏افزار با توالی‏های دیگر مرجع مقایسه و درخت تکاملی ترسیم شد. بخش میانی ژن ns3 تأیید شده و سپس به درون سازه بیانی، کلون شد و کلون‏های مناسب با استفاده از دو نوع colony-pcr شناسایی شد. ارزیابی نهایی بیان ژن با مشاهده gfp توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش rt-pcr و وسترن بلات روی سلول‏های ترانسفکت شده با سازه بیانی تأیید شد. نتایج: توالی میانی ns3 از روی سرم بیمار تکثیر و نتایج توالی‏یابی و مقایسه ژنی نشان داد که این توالی به توالی‏های مرجع شباهت داشته و در شاخه ژنوتیپ 1 ویروس هپاتیت c قرار دارد. با روش colony-pcr وجود و نیز جهت ژن درون پلاسمید بیانی تأیید شد. مشاهده gfp توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش rt-pcr و وسترن بلات به‏ترتیب نمایانگر انتقال موفق سازه، بیان ژن و نیز تولید پروتئین در سلول‏های 293 بود. نتیجه‏گیری: سازه بیانی حاوی بخش میانی ژن ns3 که بایستی فاقد فعالیت پروتئازی باشد، نسبت به طول کامل ژن ns3 می‏تواند در القای بهتر ایمنی توسط سلول‏های عرضه کننده آنتی ژنی در موارد واکسن ویروس هپاتیت c مفیدتر واقع شود.